RESUMO
Two xenic isolates and cloned cultures of Entamoeba dispar were submitted to monoxenization using Crithidia fasciculata as the associated organism. Growth in monoxenic cultivation and ability of xenic and monoxenic trophozoites to destroy VERO cells and produce lesions in hamster livers were compared to those of a virulent E. histolytica. Parental and cloned E. dispar under monoxenic cultivation showed a remarkable lower growth than the monoxenic E. histolytica and were avirulent in both in vivo and in vitro tests. When xenically cultured, trophozoites of E. dispar showed a moderate lytic activity against VERO cells (1.5 to 41.8 percent of destruction) but caused severe hepatic lesions in hamsters as those caused by the virulent E. histolytica (29 to 100 percent in prevalence and 0.86 to 4.00 in lesion degree). Although E. dispar has not been associated with invasive disease in men, the ability of xenic trophozoites to produce prominent tissue damage in experimental conditions has indicated that some strains have a considerable pathogenic potential when in presence of bacteria.
Dois isolados de Entamoeba dispar em cultivo polixênico e culturas clonadas deles obtidas foram submetidos à monoxenização utilizando Crithidia fasciculata como organismo associado. O crescimento em cultivo monoxênico dos isolados e clones, bem como sua capacidade de destruir células VERO (efeito citopático) e de produzir lesões hepáticas em hamster foram comparados a uma cepa virulenta de E. histolytica. Os trofozoítos de E. dispar em cultivo monoxênico apresentaram um crescimento nitidamente menor que o de E. histolytica e foram avirulentos tanto no teste in vivo quanto in vitro. Entretanto, isolados e clones de E. dispar em cultivo polixênico exibiram uma atividade lítica moderada sobre as células VERO (1,5 to 41,8 por cento de destruição) e causaram lesões hepáticas em hamster (29 a 100 por cento em prevalência e 0,86 a 4,00 no grau de lesão) tão extensas quanto aquelas causadas pela E. histolytica. Embora E. dispar não seja associada à doença invasiva no homem, a ocorrência de lesões teciduais significativas, causadas por trofozoítos em condições experimentais, indica que esta espécie pode apresentar potencial patogênico considerável quando em presença de bactérias intestinais.
Assuntos
Humanos , Animais , Cricetinae , Meios de Cultura , Entamoeba/patogenicidade , Fígado/parasitologia , Chlorocebus aethiops , Crithidia fasciculata , Entamoeba histolytica/crescimento & desenvolvimento , Entamoeba histolytica/patogenicidade , Entamoeba/crescimento & desenvolvimento , Fígado/patologia , Células Vero , VirulênciaRESUMO
La cinética multiplicativa de la cepa parental y cinco clones de Crithidia fasciculata (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) fue estudiada en agar sangre 40% difásico. Los clones fueron obtenidos de cultivos en agar sangre 40% y denominados Ia, IIIa, IVa, Va y CAA. En cada caso, tubos de agar sangre 40% difásico con infusión cerebro corazón 3,7 % como fase líquida fueron inoculados con 103 coanomastigotos de cada clon y la cepa parental. La concentración de parásitos fue estimada semanalmente durante 12 semanas expresando las concentraciones en coanomastigotos/mm3. La variabilidad fue evaluada por análisis de variancia (ANDEVA) para mediciones repetidas (a:0,05) realizadas durante cada día de observación. Electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) fueron también efectuadas para evaluar los perfiles proteicos de los clones y la cepa parental. Los resultados mostraron una fase de crecimiento logarítmico muy corta que antecedió a una fase estacionaria prolongada. (p > 0,05). No hubieron diferencias estasdísticamente significativas entre la concentración de coanomastigotos/mm3 entre los sistemas estudiados durante cada día de observación. Los perfiles proteicos mostraron patrones altamente homogéneos en todos los sistemas estudiados. Los resultados sugieren que las menores presiones evolutivas que sufre naturalmente C. fasciculata en su ciclo propagativo podrían estar relacionadas con la homogeneidad observada, pero es requerida más información en tópicos como inmunología, biología y genética para demostrar dicha homogeneidad.
Assuntos
Crithidia fasciculata/crescimento & desenvolvimento , Crithidia fasciculata/fisiologia , Ágar , Análise de Variância , Sangue , Células Clonais , Meios de Cultura , Eletroforese , Cinética , Trypanosoma cruzi/crescimento & desenvolvimento , Trypanosoma cruzi/fisiologiaRESUMO
Los sistemas Fenton (H2O2/Fe o H2O2/Cu) fueron capaces de inhibir la actividad topoisomerasa I de extractos crudos de Trypanosoma cruzi y Crithidia fasciculata. El agregado de compuestos de tioles o complejantes de metales, modificó la inhibición y dicho efecto dependió del metal y del origen de la enzima. El glutation reducido, DL-ditiotreitol, y N-aceti-L-cisteína 1 mM fueron efectivos protectores frente a la inhibición, inducida por el sistema H2O2/Fe, de la actividad presente en T.cruzi, el manitol protegió 37 por ciento, mientras que la histidina y etanol fueron inefectivos. Con la topoisomerasa de C.fasciculata, glutatión reducido, DL-ditiotreitol y N-acetil L-cisteína protegieron 100 por ciento a la enzima de la acción deletérea del sistema Fenton (Fe), los compuestos manitol, histidina y cisteína 1 mM protegieron 48, 34 y 28 por ciento, respectivamente, mientras que el etanol 4 mM fue inefectivo. Con el sistema H2O2/Cu y la enzima de T.cruzi, el DL-ditiotreitol y la histidina 1mM protegieron 100 y 60 por ciento, respectivamente, los otros protectores ensayados fueron menos efectivos. Resultados semejantes se obtuvieron con la topoisomerasa de C.fasciculata. La disminución por sistemas Fenton de la actividad topoisomerasa I de los extractos resultó no ser revertida por posterior incubación con los compuestos que tuvieron efecto protector. Se sugiere que la estructura molecular de la proteína podría actuar como secuestrante de radicales libres generados por los sismtemas Fenton o mediante la unión de metales como el Cu o Fe, facilitando la generación de los mismos in situ. Ambos mecanismos conducirían a la inactivación de la misma.
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Crithidia fasciculata , DNA Topoisomerases Tipo I , Trypanosoma cruzi , ArgentinaRESUMO
Mobile genetic elements, by virtue of their ability to move to new chromosomal locations, are considered important in shaping the evolutionary course of the genome. They are widespread in the biological kingdom. Among the protozoan parasites several types of transposable elements are encountered. The largest variety is seen in the trypanosomatids-Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi and Crithidia fasciculata. They contain elements that insert site-specifically in the spliced-leader RNA genes, and others that are dispersed in a variety of genomic locations. Giardia lamblia contains three families of transposable elements. Two of these are subtleomeric in location while one is chromosome-internal. Entamoeba histolytica has an abundant retrotransposon dispersed in the genome. Nucleotide sequence analysis of all the elements shows that they are all retrotransposons, and, with the exception of one class of elements in T. cruzi, all of them are non-long-terminal-repeat retrotransposons. Although most copies have accumulated mutations, they can potentially encode reverse transcriptase, endonuclease and nucleic-acid-binding activities. Functionally and phylogenetically they do not belong to a single lineage, showing that retrotransposons were acquired early in the evolution of protozoan parasites. Many of the potentially autonomous elements that encode their own transposition functions have nonautonomous counterparts that probably utilize the functions in trans. In this respect these elements are similar to the mammalian LINEs and SINEs (long and short interspersed DNA elements), showing a common theme in the evolution of retrotransposons. So far there is no report of a DNA transposon in any protozoan parasite. The genome projects that are under way for most of these organisms will help understand the evolution and possible function of these genetic elements.
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Animais , Crithidia fasciculata/genética , Elementos de DNA Transponíveis , Entamoeba histolytica/genética , Giardia lamblia/genética , Filogenia , Telômero/genética , Trypanosoma/genéticaRESUMO
Ethidium bromide (EB) is an intercalating agent which binds specifically to the kinetoplast (mitochondrial) DNA (kDNA) of trypanosomatids. Accordingly, EB inhibits DNA replication, thus inducing dyskinetoplasty. Since in eukariotic organisms mitochondrial DNA encodes the genetic information for cytochromes b, aa3 and F0F1 ATPase, it seemed of interest to establish whether a similar effect occurs in Crithidia fasciculata, a trypanosomatid used for assay of potential trypanocidal drugs. Culturing of C. fasciculata in the presence of EB inhibited growth and induced dyskinetoplasty, as confirmed by electron microscopy. The kinetoplast of EB-cultured crithidia lost its characteristic arc shape, it was misplaced in the cell cytoplasm its matrix structure and membrane differentiation were specifically modified. Dyskinetoplasty decreased crithidia respiration and oxidative phosphorylation, as indicated by the lower ATP level, ATP/ADP ratio and adenylate energy charge. The interference of EB with kinetoplastic constituents synthesis was confirmed by the lack of action of EB on crithidia in the stationary phase of growth, that ruled out direct inhibition of oxidative phosphorylation enzymes. The lipophilic o-naphthoquinone beta-lapachone produced structural alterations in kinetoplast membranes, that correlated with inhibition of oxidative phosphorylation. These latter effects involved free radicals since they were prevented by free radical scavengers.
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Animais , Crithidia fasciculata , DNA de Cinetoplasto , Etídio , Fosforilação Oxidativa/efeitos dos fármacos , Mitocôndrias , Tripanossomicidas , Trifosfato de Adenosina , ATPase de Ca(2+) e Mg(2+) , Crithidia fasciculata , DNA de Cinetoplasto , Mitocôndrias , Naftoquinonas , Compostos de SulfidrilaRESUMO
Trypanosoma cruzi, causador da tripanossomíase americana, é um microrganismo exposto a uma variedade de espécies reativas de oxigênio, geradas como conseqüência do metabolismo de drogas tripanocidas, ou pelo hospedeiro como resposta fisiológica à invasão, além daqueles produzidos internamente em conseqüência dos processos oxidativos do parasita. Em qualquer circunstância, as células precisam proteger-se contra os produtos da redução parcial do oxigênio. Os tripanossomatídeos são aparentemente deficientes na defesa antioxidante. Embora possuindo uma superóxido dismutase, carecem de glutationa peroxidase e catalase, que são necessárias para a remoção do peróxido de hidrogênio. Além disso, glutationa, o maior composto sulfidrílico antioxidante em células de mamíferos, está presente em baixas concentrações nos tripanossomatídeos...
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Anticorpos Antiprotozoários , Clonagem Molecular , Crithidia fasciculata , Glutationa Peroxidase/deficiência , Oligonucleotídeos/biossíntese , Superóxido Dismutase , Trypanosoma cruzi/imunologia , Western Blotting , Técnicas de Cultura de Células , Eletroforese em Gel de Poliacrilamida , ImunofluorescênciaRESUMO
0-Naftoquinonas, como la ß-lapachona, que fueran antes propuestas como agentes antichagásicos, han resultado potentes inhibidores del crecimiento de células tumorales humanas, lo que ha renovado el interés por esas quinonas. Por ello, se revisan ahora los mecanismos de la citotoxicidad de varias o-naftoquinonas y moléculas similares, representadas por la ß-lapachona y las mansononas. La mayoría de esas quinonas son potentes inhibidores del crecimiento de Trypanosoma cruzi. Crithidia fasciculata y Leptomonas seymouri, a concentraciones del orden de 1.0-10 µM. Su acción implica la operación de reacciones redox. La inicial de reducción de la quinona a quinol (hidroquinona), es seguida por la oxidación del quinol por oxígeno molecular. La oxidación del quinol genera radicales semi-quinona, superóxico y peróxido de hidrógeno capaces de generar el radical hidroxilo, notable por su citotoxicidad. Como consecuencia de esas reacciones se produce un "daño oxidativo", que en los protozoarios estudiados se manifiesta por la disminución del ATP celular como resultado de la inhibición de la fosforilación oxidativa. También se produce disminución de la síntesis de DNA, RNA y proteínas celulares. Al mismo tiempo, las quinonas aumentan la degradación fisiológica de las mismas moléculas. Resultados similares se obtuvieron con naftoquinona-iminas. Los grupos carbonilos vecinos y el anillo tirano son estructuras esenciales para la acción citotóxica de las quinonas. Estos efectos se discuten en relación a posibles usos farmacológicos de las naftoquinonas lipofílicas.
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Humanos , Citotoxicidade Imunológica , Dano ao DNA , Inibidores do Crescimento , Radical Hidroxila/toxicidade , Naftoquinonas/farmacocinética , Naftoquinonas/toxicidade , Neoplasias/tratamento farmacológico , Fosforilação Oxidativa , Quinonas/toxicidade , Trypanosoma cruzi , Crithidia fasciculata , Radicais Livres , Trypanosomatina , VirosesRESUMO
Molecular aspects of heat-shock response were investigated in monogenetic and digenetic members of the Trypanosomatidae and the data obtained compared. Trypanosoma cruzi and Crithidia fasciculata differ in the number of heat-shock proteins (HSPs) induced and in the range of supra-optimal temperature induction of these proteins. Whereas low molecular weight Hsps were induced by high temperature in Crithidia, this effect was only seen in T. cruzi after ethanol treatment. The 61 kDa peptide of T. cruzi, induced by heat, was characterized as a HSP60 family member by Western blot using a Mycobacterium polyclonal anti-HSP60 antibody. The HSP61 aa. sequence, deduced from the isolated HSP60 gene and its mRNA product were characterized. The predicted aa. sequence has shown the presence of a mitochondrial peptide leader and no large domains of aa. sequence conservation were found when compared to other known HSP60, in contrast to what is observed in HSP70. Furthermore, the HSP60 gene is apparently conserved in T. cruzi, C. fascilulata and Leishmania as suggested by genomic Southern blot analysis.
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Animais , Crithidia fasciculata/genética , Resposta ao Choque Térmico , Trypanosoma cruzi/genética , Sequência de Aminoácidos , Chaperonina 60/isolamento & purificaçãoRESUMO
The study of Trypanosoma cruzi type II DNA-topoisomerase should provide new clues for the rational development of new drugs for the chemotherapy of Chagas' disease. This enzyme is very likely involved in the processes leading to T. cruzi replication and differentiation since both processes are blocked by bacterial type II DNA topoisomerase inhibitors. In this article, we review and discuss our recent data related to the cloning, sequencing, and expression of T. cruzi type II topoisomerase
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Animais , DNA Topoisomerases Tipo II/metabolismo , Genes de Protozoários , Trypanosoma cruzi/enzimologia , Sequência de Aminoácidos , Doença de Chagas/tratamento farmacológico , Clonagem Molecular , Crithidia fasciculata/enzimologia , Crithidia fasciculata/genética , DNA Topoisomerases Tipo II/genética , Dados de Sequência Molecular , Alinhamento de Sequência , Homologia de Sequência de Aminoácidos , Trypanosoma brucei brucei/enzimologia , Trypanosoma brucei brucei/genética , Trypanosoma cruzi/genéticaRESUMO
Las §-naftoquinonas CG 8-935, CG 9-442, CG 10-248 y las mansonomas A, C, E y F inhiben el crecimiento de L. seymouri (LS) y C. fasciculata (CF). Las mansononas más activas fueron E y F (I50, 0.1 y 0.4 *M con LS y 0.3-1.2 *M con CF), con actividades citotóxicas iguales o superiores a las de las o-quinonas CG. La incubación de los protozoarios con las quinonas CG y las quinonas E y F indujo la producción de H2O2 y O2. Menor producción se obtuvo con la perezona y la priminina (p-benzoquinonas utilizadas como testigo). El efecto de las o-quinonas fue proprocional a su concentración y con las mansononas E y F la producción de O2 fue 4-5 veces mayor que la de H2O2. Diferencias menores se observaron con las quinonas CG. La producción de peróxidos resultó de un ciclo redox, iniciado por una fase anaeróbica (I) en la que se formaron los quinoles, seguida por una fase aeróbica (II) en la que se formó O2 y H2O2. Con las mansononas E y F, y las quinonas CG, la velocidad de la fase II fue superior o igual a la de la fase I pero, con las mansononas A y C, la velocidad de oxidación de los quinoles fue 8-10 veces menor que la de reducción de las quinonas. Esas diferencias concuerdan con a) la oxidación in vitro de los quinoles; b) su capacidad para producir O2 y c) su capacidad para inducir la quimiluminiscencia de la lucigenina. Los resultados descriptos demuestran la intervención de oxi-radicales en la citotoxicidad de las §-quinonas, no obstante la existencia de catalasa y otras enzimas protectoras en LS y CF, pero no se descartan otros mecanismos. La sensibilidad de ambos organismos a las quinonas estudiadas, similar o superior a la del T. cruzi, autoriza a utilizar a LS y CF como modelos para el ensayo de quimioterápicos antichagásicos